本文原载于《中华临床感染病杂志》年第4期
医院和社区获得性感染的重要肠杆菌科细菌。随着抗菌药物的广泛使用，产超广谱β－内酰胺酶和AmpC酶等多重耐药肺炎克雷伯菌引起的感染日益增加，而碳青霉烯类抗菌药物是治疗多重耐药菌感染的最有效药物之一。随着此类抗菌药物的大量和不合理使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(Carbapenem－resistantKlebsillapneumoniae，CRKP)逐渐出现，近年来呈不断增加的趋势，其耐药机制主要是细菌产生的碳青霉烯酶能水解碳青霉烯类抗菌药物[1]。肺炎克雷伯菌主要产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsillapneumoniaecarbapenemase，KPC)[2]，KPC酶是一种质粒介导的Ambler分类中A类丝氨酸β－内酰胺酶，能水解几乎所有的β－内酰胺类抗菌药物[3]。本医院重症监护病房(ICU)1例患者5个部位分离得到的非重复CRKP的耐药机制和同源性进行分析。
1 资料与方法
1.1 研究对象
年6月3日因大面积医院烧伤科的男性患者，年龄66岁，6月5日行创面负压封闭引流、植皮术，术后转入ICU继续治疗。患者住院期间经历了心肺复苏、深静脉插管、导尿管插管等，并给予亚胺培南/西司他丁钠(mg，1次/8h)＋利奈唑胺(mg，1次/12h)治疗，10d后，其症状未见缓解，血常规、C－反应蛋白(CRP)等指标未见明显下降。收集患者6月9日痰液、11日创面分泌物、12日深静脉导管、13日血液和16日尿液中5株菌株，并确认为CRKP，分别编号为KP1、KP2、KP3、KP4和KP5。
1.2 主要仪器与试剂
全自动微生物鉴定药敏分析仪为美国BD公司Phoneix－System系统；PCR扩增仪为美国ABI公司提供；电泳仪由北京六一仪器厂提供，凝胶成像仪由Bioshine公司提供；K－B法药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株鉴定及药敏试验
菌株经美国BD公司Phoneix－System全自动微生物鉴定药敏分析系统鉴定确认，药敏试验采用微量肉汤稀释法检测最低抑菌浓度(MIC)。结果判读按美国临床实验室标准化协会(CLSI)年版标准执行[4]。质控菌株为大肠埃希菌ATCC、铜绿假单胞菌ATCC、肺炎克雷伯菌ATCC，均购自卫生部临床检验中心。
1.3.2 改良Hodge试验
参照CLSIM－S24介绍的改良Hodge试验进行检测[4]。将0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC经1∶10稀释后均匀涂抹于MH平板，中间贴美罗培南(30μg)纸片，将受试菌株自纸片外缘向平板边缘划线接种。35℃孵育过夜，抑菌圈内出现矢状生长者为碳青霉烯酶表型阳性。阳性对照菌株肺炎克雷伯菌ATCCBAA、阴性对照菌株肺炎克雷伯菌ATCCBAA均购自卫生部临床检验中心。
1.3.3 金属β－内酰胺酶检测
采用乙二胺四乙酸(EDTA)协同试验进行检测。受试菌菌液制备和涂抹同标准的纸片扩散法，在MH平板上贴两张亚胺培南纸片(30μg)，纸片间距约为30mm，在其中一张亚胺培南纸片上滴加10μL0.5mol/L的EDTA溶液。35℃孵育过夜后阅读结果，若滴加EDTA抑制剂的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药相比≥5mm，提示该菌产金属β－内酰胺酶[5]。
1.3.4 KPC酶检测
采用3－氨基苯磺酸抑制试验进行检测。受试菌液制备和涂抹同标准的纸片扩散法，在MH平板上贴两张亚胺培南纸片(30μg)，纸片间距约为30mm，在其中一张亚胺培南纸片上滴加10μL浓度为40mg/mL的3－氨基苯磺酸溶液(终浓度为40μg/片)。35℃孵育过夜后阅读结果。若滴加3－氨基苯磺酸抑制剂的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药相比≥5mm，提示该菌产生KPC型碳青霉烯酶[5]。
1.3.5 PCR扩增
用煮沸法提取细菌DNA。采用多重PCR方法扩增肺炎克雷伯菌中常见的碳青霉烯酶基因：KPC、SHV、NDM、VIM、IMP和OXA。扩增引物序列参照Poirel等[6]研究设计(表1)。阳性对照菌株为产KPC－2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(医院提供)，阴性对照菌株为肺炎克雷伯菌ATCC。扩增反应总体积为50μL，包含DNA模板2μL、PCR缓冲液5μL、Mg2＋4.4μL、dNTP溶液1μL，上下游引物各2μL，加蒸馏水至50μL。PCR反应条件：94℃预变性10min、94℃变性30s、52℃退火40s、72℃延伸50s、共36个循环。PCR扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶，电压V，电泳时间40min，最后经溴乙锭染色20min后在凝胶成像系统上阅读结果，所得序列与GenBank中序列(早期白癜风能治好吗让白癜风患者感受中科魅力